PBJ | 合成生物学新进展：在植物细胞中成功表达流感疫苗

本文转自：植物生物技术Pbj
本研究成功在植物实现生产流感疫苗-利用病毒血凝素（HA）的瞬时表达来实现的。其中，农杆菌载体介导了这一过程。HA蛋白通过植物细胞的分泌途径产生并成熟，然后被运输到质膜，在质膜上诱导类病毒颗粒（VLP）的形成。然而，VLP 的产生不可避免地会影响植物细胞本身的生长发育。如果一味的通过增加RNA 沉默病毒抑制因子（VSR）的表达量来增加重组蛋白产量，这也会影响植物本身的生长。截至目前，关于宿主分子对外源蛋白表达的反应的研究很少。
近日，来自加拿大的Marc-Andre D’Aoust、Dominique Michaud和Peter Moffett教授在《Plant Biotechnology Journal》上发表题为“Molecular responses of agroinfiltrated Nicotiana benthamiana leaves expressing suppressor of silencing P19 and influenza virus-like particles”的文章，作者全面描述了瞬时表达VSR P19或共表达P19和HA的烟草细胞中发生的分子变化，结果发现确定了对农杆菌介导的外源蛋白表达的一般反应，包括叶绿体基因的下调表达、氧化胁迫响应的基因的上调表达以及木质化反应强化导致植物细胞壁增厚等反应。

作者首先使用多种方法对本塞姆氏烟草中农杆菌侵染、P19表达和VLP产生（共表达P19和H5）的影响进行了探究。作者发现，相对于正常培养的叶片，仅用农杆菌处理的叶子并没有发现明显的效果。对于仅表达P19的叶片，观察到叶片呈淡黄色，表明轻度失绿。相比之下，共表达P19和H5的叶子显示出更明显的失绿，以及灰色坏死斑点，表明植物细胞处于死亡激活的早期阶段。qRTPCR结果也证明了上述实验中基因的表达量都是正确无误的。蛋白实验也证明了H5蛋白只在H5样本中检测到（图1）。总而言之，作者严谨的证明了实验的无误性，可以保证开启后续实验。

而后，作者对于这几个样本的转录组进行测定。作者发现当比较只表达P19和P19和H5共表达样本时，两种蛋白的共表达会比仅P19表达出现更多的差异表达基因（图1）。并且，大多数差异表达基因的基因都是共表达样本所特有的，这表明HA蛋白的表达在植物细胞中介导了特异的分子特征。总的来说，在全局范围内，转录变化与应激表型的强度一致，共表达样本的转录变化也是最为剧烈的（图1）。

图1：胁迫表型和转录组学分析。

下面，作者通过RNA-seq的分析和实验的手段分别证明了在共表达P19和H5后，植物细胞会出现：
1、叶绿体相关基因的表达下调（图2）；
2、P19表达后HSP和伴侣基因的表达上调（图3）；
3、脂质相关基因的表达上调（图4）；
4、氧化胁迫应答相关基因的表达上调（图5）；
5、木质素单体合成和木质素聚合基因的表达上调（图6）；
6、水杨酸的含量上升（图7）；
7、PR1基因表达的上调（图7）；
8、磷脂酶A (PLA) 基因的上调（图8）；
9、乙烯（ET）生物合成基因的上调（图10）。
最后，作者发现对于共表达P19和H5的叶子，未处理的植物或喷洒模拟溶液的植物观察到相似强度的细胞死亡症状。对于喷洒抗坏血酸（AsA）的共表达P19和H5的叶子，观察到淡黄色，但几乎没有表现出坏死症状（图11）。因此，抗氧化剂的外源喷施可以减少与H5蛋白表达相关的应激症状。

图2：叶绿体相关基因的表达下调。

图3：HSP表达上调。

图4：脂质相关基因的表达。

图5：与氧化胁迫应答相关的基因表达。

图6：木质素相关基因表达及木质素定量。

图7：SA和SAR相关基因的表达分析。

图8：茉莉酸积累和氧脂素相关基因的表达。

图9：其他氧脂素调控基因的表达。

图10：ACC积累和ET相关基因的表达。

图11：抗坏血酸可减少H5诱导的应激症状。