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血红蛋白测定方法

2010-05-28 来源:亚科官网

【原理】高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁,形成高铁血红蛋白(Hi)。后者再与氰离子结合,形成稳定的氰化高铁血红蛋白(HiCN)。氰化高铁血红蛋白的最大吸收峰在波长540nm处,可用标准的高精度的分光光度计定量测定,其吸光度与血红蛋白浓度成正比。

【试剂】氰化高铁血红蛋白(HiCN)转化液:

氰化钾(KCN)                         0.05g

高铁氰化[K3FeCN6]                  0.20g

非离子表面活性剂(Triton X-100)     1.0ml

无水磷酸二氢钾(KH2PO4              0.14g

蒸馏水加至                           1000ml(纠正pH7.0~7.4)

血红蛋白转化液为淡黄色透明溶液,配成后用滤纸过滤,置棕色瓶中,在室温中可保存数月,在冰箱中稳定时间更长,但勿使结冰。该液以H2O为空白,于540nm测其吸光度应<0.001。

【器材与仪器】试管、刻度吸管、微量吸管、分光光度计。

【操作】

1.血红蛋白转化   用微量吸管取末梢血24ml,加入5ml HiCN转化液另,充分混匀,静置5min,使充分反应。

2.比色  如果使光光度计比色,波长540nm,光径 1.0cm,以转化液或蒸馏水为空白,测定样本吸光度(A)

3.计算  如果使用符合WHO标准的分光光度计,可根据样本吸光度值(A)直接计算出血红蛋白浓度。

计算公式为:

式中:64458是国际公认的血红蛋白分子量,64458mg/L即为1mmol/L血红蛋白的物质浓度,除以1000换算为g/L。

44是1mmol/L血红蛋白在1.00cm光径,l540nm条件下的吸光系数。

251是稀释倍数。

4.当使用的分光光度计不符合WHO标准时,可先使用已知浓度的血红蛋白标准液制作,HiCN的标准曲线,然后根据样本吸光度在标准曲线上查取血红蛋白浓度。

【注意事项】

1.使用光电比色计之前须校正仪器。

2.采血用的血红蛋白吸管20ml的准确性±1%以内,5.0ml移液管的准确性应在±0.5%以内。当使用标准曲线时,应定期对标准曲线进行校正。

3.样吕在读数前应清晰,如发生混蚀,可能有以下几种情况:

(1)血中白细胞过多,可离心后取上清比色。

(2)血中有异常球蛋白,可在溶液中加0.1g碳酸钾。

(3)有硫化血红蛋白或血红蛋白C时,则可用蒸馏水按1:1稀释,结果乘以2即可。

(4)氰化试剂是剧毒品,在配试剂时要严格按剧毒品操作。如发现变绿、弯混则不能使用,pH低于7.0时应进行调整。

 4.血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中,否则CN-浓度下降,致使结果偏低。


【参考值】成年男性    120~160g/L

          成年女性    110~150g/L

          新 生 儿    170~200g/L

【临床意义】血红蛋白减少和增多临床意义与红细胞计数相似。但在某些贫血时,由于红细胞平均血红蛋白含量不同,红细胞和血红蛋白减少程度可不一致,如小细胞低色素贫血时,血红蛋白减少比红细胞减少更为显著,而大细胞性贫血时红细胞的减少比血红蛋白减少为显著。因些同时测定红细胞和血红蛋白,对贫血类型的鉴别有重要意义。



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