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基于单颗粒计数的癌症标志物高灵敏分析检测

2024-01-30 来源:转载自第三方

本文转自x-mol
前列腺癌位列男性恶性肿瘤发病率的第6位,死亡率占癌症总死亡人数的10%,其发病率随着年龄的增长而增长。一般来讲,55岁后的男性发病率处于较高水平。早期得到及时诊断的前列腺癌患者可通过根治性治疗方法达到治愈的目的,因此及时而精准的诊断在一定程度上可以挽救上百万的生命。血清中PSA(前列腺特异性抗原)是中性的丝氨酸蛋白酶,是一种存在于细胞间的糖蛋白。血清中PSA的水平高低是前列腺癌临床诊断以及根治性治疗方法评价的主要依据之一。研究表明,血清中PSA的含量在60-90 pM范围之间的人群,在15年内患前列腺癌的可能性较大。目前,PSA的含量水平一般通过临床免疫反应来检测,包括荧光光谱检测、酶联免疫吸附以及电化学分析等,但这些方法一般都存在一定的局限性,例如灵敏度较低、检测周期较长。有没有一种方便、快捷而又灵敏度高的检测手段来进行血清PSA水平的度量呢?近日,南开大学的肖乐辉教授(点击查看介绍)团队基于单颗粒计数的均相免疫吸附方法,使用上转换纳米颗粒(UCNPs)实现了对前列腺癌标志物PSA的高灵敏检测。

与传统的宏观检测相比,单颗粒/单分子计数法具有较高的灵敏度和分辨率等优点,因此越来越多地应用于癌症标志物的检测。迄今为止,基于这种方法,许多生物(纳米纤维和蛋白纳米颗粒)以及非生物纳米颗粒(量子点以及其他荧光纳米颗粒)已经成功用于癌症标志物的检测。另外,高灵敏检测方法的开发需要在检测技术上考虑使用材料的光学特性,例如良好的抗漂白性、化学稳定性以及较高的量子产率等。这些优异的光学特性可以有效规避生物样本的自发荧光,进而提高分析检测的灵敏度、降低样本的检测下限。

图1. UCNPs的光学显微成像光路以及基于单颗粒计数的免疫分析原理图。

作者首先合成了尺寸均一、分散性良好的上转换纳米颗粒(UCNPs)。这种上转换纳米颗粒具有较好的光学稳定性、抗漂白性、低毒性以及较高的量子产率等优点。此外,近红外光激发还可以有效屏蔽复杂生物环境下生物样本的背景荧光,从而提高成像的信噪比、增强检测的灵敏度。在该工作中,修饰捕捉抗体的金纳米颗粒(GNPs-Ab2)与修饰检测抗体的上转换纳米颗粒(UCNPs-Ab1)基于待检测物PSA抗原与抗体间的特异性结合作用相互靠近。根据抗原含量水平的高低,两颗粒之间的作用力随之变化,当作用力达到一定水平,两颗粒之间的距离足够近时,基于能量共振转移原理,上转换纳米颗粒的荧光发生淬灭,从而达到对PSA高灵敏检测的目的。该团队首先通过原位实验在Tris-HCl缓冲溶液体系中验证了这一概念,UCNPs-Ab1通过静电作用吸附在氨基化的载玻片上,随着抗原和GNPs-Ab2的加入,上转换纳米颗粒的荧光逐渐淬灭。颗粒的光谱和抗漂白性表征都再次验证了上述实验的可行性。

图2.(a)UCNPs-Ab1在载玻片表面的荧光图像;(b)UCNPs-Ab1在载玻片表面,原位加入抗原和GNPs-Ab2后的荧光图像;(c)UCNPs-Ab1和GNPs-Ab2混合样品在加入抗原前(红色)和加入后(绿色)的发射光谱;(d)UCNPs在长时间曝光下的单颗粒荧光成像;(d)单个颗粒(对应d中标记颗粒)强度随时间的变化。

接着,该团队探究了实验中使用的单颗粒免疫传感对癌症标志物的检测灵敏性。研究发现,吸附在玻璃基底的上转换纳米颗粒随着癌症标志物PSA含量的增加,荧光颗粒的个数逐渐减少。实验中使用的PSA浓度范围在0-500 pM,通过免疫吸附曲线发现,在0-60 pM的范围内,上转换纳米颗粒的荧光淬灭效率随着PSA浓度的增加而线性增加,检测下限可以达到1.0 pM,这一结果远远低于病人血清PSA的最低水平(117.6 pM)。结果证明,该工作中使用的基于能量转移的单颗粒计数免疫分析体系在前列腺癌的早期检测中具有较大的潜能。

图3.(a)在缓冲溶液体系中加入不同浓度的抗原,UCNPs在载玻片表面的荧光图像;(b)PSA免疫分析标准曲线;(c)PSA定量分析的线性范围。

该团队还探究了免疫传感器的选择性。在相同的实验条件下,上转换纳米颗粒在掺杂了不同物质(包括IgG、HAS、Na+、K+)的PSA抗原体系中仍然具有与单独的PSA抗原检测中类似的检测灵敏度。此外,在单独的IgG、HAS、Na+、K+体系中,上转换纳米颗粒的荧光基本不会淬灭。研究表明,该免疫传感体系对PSA的检测具有较好的特异性。基于该技术的高灵敏度以及较好的选择性,他们最后还检测了人血清中PSA的含量水平。研究发现,与缓冲溶液体系类似,随着PSA含量的增加,玻璃基底上荧光颗粒的数目逐渐减少。其检测在0-40 pM之间具有较好的线性范围,检测下限可以达到2.3 pM,这一结果也远低于前列腺癌病人血清中PSA的最低含量。

图4.(a-f)血清体系中加入不同浓度的抗原,UCNPs在载玻片表面的荧光图像;(g)血清中,PSA定量分析的线性范围。

综上所述,该方法在前列腺癌标志物PSA的检测中表现出高灵敏度、高选择性以及方便快捷的优点,对未来临床应用中癌症标志物的定量和选择性检测都具有较好的指导意义。相关成果近期发表在Analytical Chemistry 上。

该论文作者为:Xue Li, Lin Wei, Lanlan Pan, Zunyan Yi, Xiao Wang, Zhongju Ye, Lehui Xiao, Hung-Wing Li and Jianfang Wang


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