PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR的区别

本文转自病理柳叶刀
在学习过程中，我们经常会遇到各种PCR字眼，什么qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，你了解PCR这个大家族吗？还在傻傻分不清吗？
一、什么是PCR？
PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术自问世以来，在生物科学领域、分子诊断领域、亲子鉴定、法医鉴定以及犯罪调查等方面发挥了巨大作用，是迄今为止最为重要的技术之一。经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。

图1 PCR仪器的发展历程（Lee NY., 2018）
二、PCR的原理
PCR的基本原理与DNA的体内复制相类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经高温（95℃左右）加热一定时间后，使其解离成单链，以便它与引物结合；
②模板DNA与引物的退火（复性）：将温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合；
③引物的延伸：再将温度调至72℃左右（DNA聚合酶最适反应温度），DNA模板和引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按碱基配对与半保留复制原理，沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这样经变性、退火和延伸重复若干个循环后，就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

图2 PCR的基本反应步骤
三、PCR的分类
1.普通 PCR
普通PCR即一代PCR，使用普通PCR扩增仪扩增靶基因，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。
2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。
①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。
优点：价格相对较低；使用方便；对DNA模板没有选择，通用性好；检测灵敏度高。
缺点：可能产生假阳性结果，需要通过熔解曲线分析识别扩增产物的特异性；需要不断优化反应体系以降低非特异性扩增；不适合进行多重qPCR检测。
②荧光探针法（TaqMan技术）：TaqMan探针是最早用于定量的方法，也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5'端标记一个荧光报告基团（Reporter, R），3'端标记一个淬灭基团（Quencher, Q）。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。
优点：检测特异性强；灵敏度高；适合进行多重qPCR检测；PCR后续无需处理，节省时间和原料成本。
缺点：需要根据不同的序列，合成不同的探针；探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性，定量时容易受试剂和酶性能影响；淬灭难以彻底，本底较高；检测结果很难判断实际的扩增特性。

图3 荧光染料法和荧光探针法的工作原理（Cao et al., 2020）
注：多重PCR，也称多重引物PCR或复合PCR，是在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的一种新型PCR扩增技术。
3.数字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
数字PCR被称为第三代PCR技术，作为一种新兴技术与旧的PCR技术（例如实时定量PCR）相比，可针对核酸分子做更精确的定量分析（Pinheiro LB, et al.2012;84:1003–11）。数字PCR的创新之处在于标准PCR反应体系经过微滴发生，将目标分子稀释到多个微滴中，每个微滴大体上只包含一个或不包含目标DNA模板，实现”单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有目标分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。因此，无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量。
4. 逆转录PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）
逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。
5.实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法：一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA，然后再将其作为qPCR扩增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行，两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。

图4 RT-qPCR的一步法和两步法（Soler et al., 2020）
四、结语
1.PCR，通常指的是普通PCR，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，定性扩增双链DNA。
2.qPCR和Real-time PCR，指的是实时荧光定量PCR，以cDNA为模板，以dNTP为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。
3.RT-PCR，指的是逆转录PCR，以由mRNA逆转录成的cDNA为模板，以dNTP为底物，进行DNA的扩增，属于PCR的变种，结果只能定性，不能定量。
4.RT-qPCR，指的是实时荧光定量逆转录PCR，是qPCR+RT-PCR的组合，将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板，以dNTP为底物，进行qPCR的定量分析。
表1 不同PCR方法的主要优缺点

来源：公众号细胞与基因治疗领域、Gene Diagnosis等处