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薄层板的制备、活度测定及应用

2011-07-31 来源:亚科官网

 

1.实验原理

1.1 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。  根据分离的原理不同,薄层层析可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层,属于分配薄层层析。薄层层析中以吸附薄层为多用,吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。

1.2 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同,及展开剂对它们的解吸附能力的不同,使各成分达到分离。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力,还受被吸附成分的性质影响,更与展开剂的性质有关。

1.3 分配薄层层析的原理是,用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物,铺成薄层(或装柱),然后活化、点样(或上样),再用极性较弱的展开剂(或洗脱剂)进行展开。在展开过程中,各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配。由于各成分在两相间的分配系数不同,因而可以达到相互分离的目的。

     化合物的吸附能力与它们的极性成正比,具有较大极性的化合物吸附较强,因此Rf值较小。在给定的条件下(吸附剂、展开剂、板层厚度等),化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的,即Rf值是化合物的物理常数,其大小只与化合物本身的结构有关,因此可以根据Rf值鉴别化合物。

1.4 薄层层析可适用小量样品(几到几十微克甚至0.01μg)的分离:也可用于多达500mg样品的分离,是近代有机化学中用于定性,定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物,以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。

 

2.实验步骤

2.1 薄层板的制备

2.1.1 氧化铝羧甲基纤维钠薄层

取氧化铝粉末一份,置烧杯中加适量的羧甲基纤维素钠溶液搅拌,直至混合成搅拌时,物质能够在玻璃棒上掉下时成一条状,放置片刻,待杯里没有气泡后用药匙取一定量,分别倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中,推动涂布),均匀涂布成0.25~0.5mm厚度,轻轻振动玻璃板,使薄层面平整均匀,在水平位置放置,待薄层发白近干,于烘箱中110活化0.5~1小时,冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整,一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时,所用薄层板只在空气中自然干燥,不经活化即可贮存备用。

2.1.2硅胶G薄层 

 取硅胶G或硅胶GF一份,置烧杯中加水约5份混合均匀,放置片刻,待杯里没有气泡后用药匙取一定量,分别倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中,推动涂布),均匀涂布成0.25~0.5mm厚度,轻轻振动玻璃板,使薄层面平整均匀,在水平位置放置,待薄层发白近干,于烘箱中110℃活化0.5~1小时,冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整,一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时,所用薄层板只在空气中自然干燥,不经活化即可贮存备用。

2.1.3硅胶(H)羧甲基纤维钠(CMC-Na)薄层  

取羧甲基纤维素0.2g,溶于25ml水中,在水浴上加热搅拌使完全溶解,静置一夜,取上层清液,加薄层层析用硅胶(颗粒度10~40μm的约6~8g)。激光照排系统混成均匀的稀糊,按照硅胶G薄层涂布法制备薄层,或取0.8%羧甲基纤维纳10ml,倒入广口瓶(高约10~12cm)中,然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克,不断振摇成均匀的稀糊,把两块载玻片面对面结合在一起,这样每片只有一面与硅胶糊接触,使薄片浸入硅胶稀糊中,然后慢慢取出,分开二块薄片,将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上,让其自然阴干,100℃下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内,以供再用。

2.2 吸附剂的活度测定

2.2.1氧化铝活度的测定:一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。

常法制备含粘合剂氧化铝薄层,以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点,分别用毛细管吸取0.02ml染料试剂苏丹红、二甲基黄、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅱ四氯化碳溶液、偶氮苯溶,分别点滴于原点上,以四氯化碳为展开剂,展开时薄层板与容器底部交角为10~40°之间,展开后测出各斑点的Rf值,从表1确定氧化铝的活度(一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时,结果往往偏低)。

1  氧化铝活度与偶氮染料外值关系

偶氮染料

氧化铝活度级Rf

二级

三级

四级

五级

偶氮苯

0.59

0.72

0.85

0.95

对甲氧基偶氮苯

0.16

0.45

0.69

0.89

苏丹黄

0.02

0.25

0.87

0.98

苏丹红

0.00

0.10

0.35

0.50

对氨基偶氮苯

0.00

0.05

0.08

0.19

 

2.2.2 硅胶活度的测定:一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。

分别用毛细管吸取苏丹红、二甲基黄、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅱ四氯化碳溶液、偶氮苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上,以苯为展开剂,展开10cm(约20分钟)。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间,则认为薄层板活性符合要求。

2.3 薄层层析的应用

分别用毛细管吸取湖北贝母总生物碱氯仿溶液点滴在硅胶CMC- Na薄层,以C6H5-EtoAc-NHEt2641)为展开剂进行展开,待展开剂上到离薄层板顶端约1cm时,取出,晾干薄层板,然后再薄层板上喷洒显色剂改良碘化铋钾喷雾,晾干,观察薄层板分离效果。重复上述操作,吸附剂改为硅胶G-CMc-Na板,样品改为丹参乙醚提取液,展开剂改为石油醚-醋酸乙酯(41)。

 

3.实验结果

3.1 实验制备的含粘合剂氧化铝薄层板容易掉粉末,粘合效果欠佳,并且稍微刮碰,即出现刮伤状的凹凸不平,氧化铝薄层板质量欠佳。

3.2 实验制备的硅胶G薄层,表面平整均匀,无明显的气泡,并且硅胶的粘合效果良好,不易掉粉,硅胶G薄层板的质量良好。

3.3 实验制备的硅胶H薄层,表面平整均匀,无明显气泡出现,但是稍微一抹,薄层板掉粉现象严重,粘合效果欠佳,说明薄层板的质量欠佳。

3.4 对薄层板进行活度测试

3.4.1对氧化铝薄层板活度测试,观察薄层板,发现拖尾现象较严重,每个样品的大点后面都有很长的一条线,造成此原因可能为点样太浓了和点样之后没吹干溶剂。把表2与表1数据对比,对偶氮苯展开氧化铝的活度为三级,对苏丹红展开氧化铝的活度为四级,而其他三个样品二甲基黄、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的Rf值也较高,氧化铝活度级数都较高,说明实验制备的氧化铝薄层板的含水量高,活性较低,其吸附能力较低。而一般常用的是二级与三级吸附剂,一级的吸附性太强,而且容易吸水,五级的吸附性太弱。

                   

 

2 氧化铝薄层板活度测试展开剂为四氯化碳

     偶氮染料

项目

二甲基黄

偶氮苯

苏丹红Ⅱ

苏丹红

苏丹红Ⅳ

X/cm

1.1

3.0

1.6

1.4

0.6

Y/cm

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

Rf

0.28

0.75

0.4

0.35

0.15

3.4.2 对硅胶G薄层板活度测试,观察薄层板情况,可以看到有拖尾现象,而且二甲基黄,偶氮苯的点扩散成一个很大的点,造成此原因可能是点样的量过多同时没有吹干溶剂,使得展开的时候样品扩散。从表3可以看到,各个样品的Rf值都较大,说明吸附剂的吸附效果不太好。

3  硅胶G薄层板活度测试  展开剂为苯

     偶氮染料

项目

二甲基黄

偶氮苯

苏丹红Ⅱ

苏丹红

苏丹红Ⅳ

X/cm

3.0

4.3

2.3

2.4

2.1

Y/cm

4.7

4.7

4.7

4.7

4.7

Rf

0.64

0.91

0.49

0.51

0.45

 

3.4.3 对硅胶H薄层板活度测试,观察薄层板,可以看到有严重的拖尾现象,而且溶剂泡过的地方吸附剂有明显的脱落现象,与硅胶G薄层板相比,可能少了石膏粘合剂而且羧甲纤维素钠添加的量少,同时粘合效果不佳,造成硅胶H薄层板脱落严重。

 

 

4 硅胶H薄层板活度测试  展开剂为苯

     偶氮染料

项目

二甲基黄

偶氮苯

苏丹红Ⅱ

苏丹红

苏丹红Ⅳ

X/cm

3.3

4.3

2.6

2.5

2.4

Y/cm

4.6

4.6

4.6

4.6

4.6

Rf

0.72

0.93

0.56

0.54

0.52

3.4.4 对硅胶GF高效板活度测试,观察薄层板,样品在薄层板上明显呈一点状,后面无拖尾现象,与自行铺设的薄层板相比,样品点清晰,容易判断,展开效果好。从表5可以看到,个样品的Rf都落在了0.2~0.8的区间上,展开效果好。

5 硅胶GF254高效板活度测试  展开剂为苯

     偶氮染料

项目

二甲基黄

偶氮苯

苏丹红Ⅱ

苏丹红

苏丹红Ⅳ

X/cm

2.2

2.8

2.3

2.0

3.4

Y/cm

3.8

3.8

3.8

3.8

3.8

Rf

0.58

0.73

0.61

0.53

0.89

3.5 取硅胶Gf高效板对湖北贝母生物碱成分进行检识,在展开剂C6H5-EtoAc-NHEt2641)展开之后,吹干,观察薄层板无点,无现象,放在紫外灯下明显看到样品点留在原点,无展开现象,而喷洒显色剂之后,原点上的两个样品变成黑色。换成展开剂为C6H5-EtoAc-NHEt2341),其极性提高,样品点有稍微的上升。说明样品中的生物碱的极性较高,需要换成极性高的展开剂才能得到好的分离效果。

3.6取硅胶Gf高效板对丹参色素进行检识,在展开剂石油醚-醋酸乙酯(91)展开之后,吹干,观察到薄层板上距离原点线约0.5cm处有明显的点,而且点后面出现成一条线状的拖尾现象,展开剂的极性过低,对样品的展开效果欠佳,样品点上升的高度过低。

 



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